人源諾如病毒（HuNoVs）是導致急性胃腸炎的主要病原體。由于缺乏合適的培養(yǎng)系統(tǒng)，HuNoVs的發(fā)病機制以及疫苗和藥物的開發(fā)進展緩慢。雖然研究人員在上個世紀采用了多種方法在體外培養(yǎng)HuNoVs（圖1），但病毒無法穩(wěn)定增殖、病毒滴度低、重復試驗不穩(wěn)定等問題仍然不可忽視。

圖1 諾如病毒體外培養(yǎng)方法^[1]

背景介紹

諾如病毒可分為10個基因群（genogroups）和48個基因型（genotypes），而與人類感染相關的有五個基因群：GI、GII、GIV、GVIII和GIX。全球50%的諾如病毒疫情與GII.4基因型相關，自1990年代以來，該基因型的病毒株導致了六次大流行。在2014年冬季，GII.17在亞洲出現(xiàn)，逃逸了群體免疫，引發(fā)了中國和日本的廣泛爆發(fā)，并在某些地區(qū)取代了GII.4。近年來，非GII.4病毒如GII.2和GII.3也在多個國家引發(fā)大規(guī)模疫情。

腸道上皮細胞系

腸道上皮細胞是HuNoVs從粘膜表面侵入內部時首先接觸到的細胞類型。在陽性患者的近端小腸活檢中觀察到的病理特征包括絨毛縮短、黏膜炎癥以及腸道上皮細胞出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，伴有微絨毛縮短。此外，對一名急性HuNoVGII.4悉尼毒株腹瀉的兒科腸移植患者不同部位的腸道活檢組織進行分析發(fā)現(xiàn)，人類諾如病毒靶向腸內分泌細胞（EECs），這是一種具有感覺和內分泌功能的特化上皮細胞。這些跡象表明腸道上皮細胞與HuNoV感染過程密切相關，因此研究人員最初試圖在腸道上皮細胞中培養(yǎng)HuNoVs。

White等人特意將放射性標記的重組諾如病毒病毒樣顆粒VLPs結合到13種不同的細胞系上，發(fā)現(xiàn)分化的人結腸癌細胞（Caco-2）與 VLPs的結合最多，顯著高于未分化的Caco-2細胞和其他細胞。與此同時，當Duizer等人嘗試將HuNoVs接種到包括Caco-2在內的八種人腸道上皮細胞系時，發(fā)現(xiàn)沒有一種細胞系能夠實現(xiàn)顯著的基因拷貝數(shù)增加或新感染病毒的產生。

抗原呈遞細胞

抗原呈遞細胞（APCs）是一類能夠攝取和處理抗原并將其呈遞給T細胞的免疫細胞，包括巨噬細胞（MΦ）、樹突細胞（DCs）和B細胞。Wobus等人于2003年發(fā)現(xiàn)了第一株小鼠諾如病毒（MNV），并隨后發(fā)現(xiàn)MNV能夠在DCs和MΦ中有效復制，因此建立了諾如病毒的首個細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。盡管小鼠無法感染HuNoVs，但通過低劑量注射HuNoV VLPs可以在體內刺激IgG和IgA介導的適應性反應，因此推測HuNoVs在感染宿主后也會產生細胞適應性免疫反應。Ponterio等VLPs能夠誘導APCs的激活和成熟。然而，當HuNoVs與來自易感個體的單核細胞亞群衍生的DCs和MΦ在體外培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)部分外周血單核細胞衍生的DCs能夠表達病毒VP1和VPg蛋白，但所有細胞中的病毒RNA拷貝數(shù)并未增加；2014年，Jones等人成功將HuNoVs GII.4毒株、MNV-1和MNV-3接種到B細胞系（BJAB細胞系）中，增加了病毒拷貝數(shù)并產生了結構/非結構蛋白，進一步證明了通過傳代實驗產生新感染病毒顆粒的可能性。然而該團隊強調了實驗成功需要考慮的多種因素；接種液必須是未經(jīng)過濾的病毒陽性糞便上清液，因為腸道微生物的存在是HuNoV感染的重要共同因子。此外，參與的B細胞類型（可以在BJAB和Raji細胞中復制，但不能在Namalwa和HuNS1細胞系中復制）、它們的狀態(tài)和密度也會影響感染的效率，此外還有培養(yǎng)基中胎牛血清的來源。盡管這個體外培養(yǎng)系統(tǒng)最初取得了一定成功，但仍然存在一些問題。這個培養(yǎng)系統(tǒng)只能適度增加HuNoV基因組拷貝數(shù)，不能產生體內觀察到的病毒復制水平。

3D細胞聚集體

幾十年來，HuNoVs的二維單層細胞培養(yǎng)系統(tǒng)一直以失敗或低效率告終。在感染病毒的活體動物中，細胞在三維環(huán)境中協(xié)同工作，這種空間環(huán)境可能對病毒或其他傳染病原體的感染至關重要。

1998年，美國國家航空航天局（NASA）報告了使用旋轉壁反應器（RWV），該反應器模擬微重力和低流體剪切環(huán)境，使得其中培養(yǎng)的細胞能夠形成極性和三維聚集體；這使得能夠有效重建原生組織的結構，并模擬人類微環(huán)境。自引入以來，研究人員使用該反應器培養(yǎng)來自多個器官（淋巴、肺、腎、胃、腸、陰道等）的細胞聚集體，并深入探討所涉及病毒的發(fā)病機制。Straub等人應用RWV技術，成功地在3D人胚小腸上皮（INT 407）聚集體中培養(yǎng)了兩種HuNoV毒株（GI.1和GII.4），并進行了多次傳代。感染HuNoVs一天后，細胞聚集體表現(xiàn)出空泡化和微絨毛縮短，從細胞載體上脫落；它們還呈現(xiàn)出細胞病理效應（CPE），細胞形態(tài)變得延長或扭曲。隨后，研究團隊在Caco-2的3D聚集體中培養(yǎng)了兩種HuNoV毒株GI.1和GII.4；在感染的聚集體中顯示出2–3 Log10的病毒RNA拷貝數(shù)。然而，其他實驗室在使用相同方法培養(yǎng)3D聚集體的INT 407或Caco-2細胞后，沒有病毒復制的跡象；不過觀察到了細胞分化和頂端絨毛的形成。

人類腸道類器官（HIE）

2009年Hans Clevers團隊成功地在體外培養(yǎng)了小鼠腸道干細胞，使其在非上皮生態(tài)位中形成具有多種分化細胞類型（包括干細胞、腸細胞、杯狀細胞和腸內分泌細胞）的絨毛腸上皮結構域，這些細胞具有長時間生長的能力。自那時以來，這項技術迅速發(fā)展，創(chuàng)造了腸道、腦、胃、肺、卵巢等多種類型的類器官。類器官能夠模擬和反映人類器官在不同環(huán)境中的狀態(tài)，因此被廣泛應用于病原微生物感染、藥物開發(fā)和篩選、再生醫(yī)學和精準醫(yī)學等多個領域。

人類腸道類器官（HIE）包含具有隱窩樣增殖區(qū)的腸上皮的主要細胞類型。結合上皮單層細胞系的高通量與實驗動物腸道的復雜性，HIE在研究人類腸道相關疾病方面得到了廣泛應用，并為各種病毒的體外培養(yǎng)提供了新的方向

2016年，Mary K. Estes團隊培養(yǎng)了來源于空腸的單層HIE，系統(tǒng)有效表征了不同亞型HuNoVs的復制（在96小時后，HuNoV基因組RNA增加了1.5–2.5 log10，感染細胞占35–45%，透射電子顯微鏡下可觀察到典型的病毒顆粒結構）和傳代（四次連續(xù)傳代存在病毒的感染性后代的產生）。研究人員發(fā)現(xiàn)，膽酸等添加劑能夠促進GII.3和GII.17兩個亞型的復制，并促進GII.4亞型的復制；這項研究代表了HuNoVs體外培養(yǎng)的重大突破，極大推動了對HuNoVs的基礎研究。實驗結果被多個國家的實驗室成功驗證，多種HuNoVs基因型（GI.1、GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.8、GII.12、GII.14和GII.17）實現(xiàn)復制。

斑馬魚模型

斑馬魚因其發(fā)育透明、易于遺傳操作以及具有與人類相似的免疫系統(tǒng)，成為了研究病毒與宿主相互作用的重要模型。在諾如病毒的研究中，科學家們利用斑馬魚的胚胎和幼魚模型發(fā)現(xiàn)，諾如病毒能夠感染斑馬魚的腸道上皮細胞，通過模仿人類的感染途徑，斑馬魚模型幫助科學家解析諾如病毒如何與宿主細胞結合、進入細胞以及復制的詳細過程。

在斑馬魚幼蟲中復制在感染后第天達到峰值，至少可在6天內檢測到。HuNoV GII.4 可以在幼蟲之間連續(xù)傳代2次?？共《局委熆蓹z測到HuNoV復制減少了>2 log10，表明該模型適用于抗病毒研究。斑馬魚模型為篩選抗諾如病毒藥物提供了一個有效的平臺。通過在感染斑馬魚中測試不同的化合物，研究人員可以快速評估這些藥物的活性，進而為疾病的治療提供新的思路。

參考文獻：[1] Cheng C, Cai X, Li J, Zhang X, Xie Y, Zhang J. In Vitro Culture of Human Norovirus in the Last 20 Years. Biomedicines. 2024, 24;12(11):2442.

來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~薛亮。