一、蠟樣芽孢桿菌及其危害
蠟樣芽孢桿菌是一種廣泛存在于環(huán)境、食品、植物根際以及動物腸道中的革蘭氏陽性菌。它能產(chǎn)生多種腸毒素，如非溶血性腸毒素（Nhe）、溶血素BL（HBL）、細胞毒素K（CytK）等，這些毒素可引起腹瀉或嘔吐等食物中毒癥狀。特別是在米飯、面條、面粉和乳制品等食品中，蠟樣芽孢桿菌的污染風(fēng)險較高。據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心（CDC）統(tǒng)計，每年因食用受污染食品而導(dǎo)致的食物中毒病例超過63,400例。
二、傳統(tǒng)檢測方法的局限性
傳統(tǒng)的檢測方法主要包括生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。生物學(xué)方法雖然可以定性檢測Nhe毒素，但其特異性較差且存在倫理限制；免疫學(xué)方法基于抗原-抗體反應(yīng)，可用于定性和定量檢測，但傳統(tǒng)抗體的制備過程復(fù)雜且成本高昂；分子生物學(xué)方法如常規(guī)PCR、RT-PCR、多重PCR（mPCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）和CRISPR等，雖然具有較高的靈敏度，但操作繁瑣、耗時較長，需要提取DNA并進行特定片段的擴增。
三、新型重組抗體檢測技術(shù)
為了克服傳統(tǒng)方法的不足，研究人員開發(fā)了一種基于重組抗體的檢測技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（DAS-ELISA）和側(cè)向流動免疫層析法（LFIA）。具體步驟如下：
圖 1. 單克隆抗體的制備、篩選及抗原 - 抗體相互作用分析。（a）單克隆抗體的制備與篩選，（b）重組全長抗體的生產(chǎn)方案，（c）模型抗體、抗原與抗體之間的分子對接和分子動力學(xué)分析。
1、 高純度Nhe A抗原表達與純化：通過生物信息學(xué)工具預(yù)測Nhe A的信號肽、跨膜區(qū)域、等電點和構(gòu)象，選擇合適的表達載體（pET28a），并在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達和純化Nhe A蛋白。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)溫度為16℃、IPTG濃度為0.3 mM時，Nhe A的表達量最高，純度可達90%以上。
2、單克隆抗體（mAbs）制備與篩選：使用純化的Nhe A抗原免疫小鼠，獲得單克隆抗體（mAbs）。通過棋盤法篩選出最佳配對的mAbs（5C1-8G7和13E12-8G7），并建立了DAS-ELISA檢測體系，檢測限（LOD）分別為0.35 ng/mL和1.25 ng/mL。
3、重組抗體（rAbs）表達與純化：從雜交瘤細胞中提取重鏈（VH）和輕鏈（VL）基因，構(gòu)建表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染Expi293F細胞，最終獲得了高產(chǎn)量的重組抗體（rAbs），最高產(chǎn)量可達100 mg/L。
4 、LFIA建立與優(yōu)化：利用金納米顆粒（AuNPs）標(biāo)記rAbs，建立了LFIA檢測平臺。通過對AuNPs標(biāo)記量、捕獲抗體濃度、檢測抗體濃度和緩沖液pH值等條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了對Nhe A的快速、靈敏檢測。在實際樣品檢測中，LFIA對生菜、白菜和牛奶中Nhe A的檢測限分別為5.52 ng/mL、3.28 ng/mL和2.6 ng/mL。
圖2 不同食品基質(zhì)中 LFIA 的性能評估（a - c）圖像以及（d - f）應(yīng)用于生菜、大白菜和牛奶的 LFIA 相應(yīng)校準(zhǔn)曲線，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差（n = 3）。
四、分子對接與動力學(xué)模擬
為進一步揭示抗原-抗體相互作用機制，研究人員進行了分子對接和動力學(xué)模擬研究。結(jié)果表明，氫鍵在Nhe A與rAbs（5C1、8G7和13E12）的結(jié)合過程中起著重要作用。具體來說，5C1 VH中的TYR33、TRP50和THR58與Nhe A中的LYS236、GLN70和HIS386形成了氫鍵；8G7 VH中的THR28、ASN31、ASN59和TYR94也與Nhe A中的多個氨基酸殘基形成了氫鍵。此外，分子動力學(xué)模擬顯示，5C1-Nhe A和8G7-Nhe A復(fù)合物在模擬過程中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和結(jié)合親和力。
五、結(jié)論與展望
本研究成功開發(fā)了一種基于重組抗體的非溶血性腸毒素快速檢測技術(shù)，不僅解決了傳統(tǒng)雜交瘤細胞染色體丟失的問題，還為抗體序列保護提供了新的思路。該技術(shù)在實際應(yīng)用中表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度和特異性，能夠在8分鐘內(nèi)完成檢測，成本低廉且易于操作。未來，研究人員將進一步擴展該技術(shù)的應(yīng)用范圍，涵蓋更多種類的食品基質(zhì)，如大米、肉類和海鮮等，為食品安全監(jiān)管提供更加全面的技術(shù)支持。
文章來源：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2025.137825
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~楊融。
