RPA-CRISPR/Cas12a技術(shù)在大腸桿菌O157:H7現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中的應(yīng)用
RPA-CRISPR/Cas12a技術(shù)的優(yōu)勢(shì)
RPA（重組酶聚合酶擴(kuò)增）是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，能夠在37℃至42℃的恒溫條件下快速擴(kuò)增DNA，具有操作簡(jiǎn)便、快速高效的特點(diǎn)。CRISPR/Cas12a系統(tǒng)則是一種基于CRISPR技術(shù)的基因編輯工具，能夠特異性地識(shí)別并切割目標(biāo)DNA序列。將RPA與CRISPR/Cas12a結(jié)合，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)快速的DNA擴(kuò)增，還能通過(guò)CRISPR/Cas12a的特異性識(shí)別能力，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。
在最新研究中，研究人員通過(guò)優(yōu)化RPA反應(yīng)條件和CRISPR/Cas12a檢測(cè)參數(shù)，包括引物設(shè)計(jì)、crRNA濃度和轉(zhuǎn)切割時(shí)間等，成功將檢測(cè)的視覺(jué)下限降低到101 CFU/g，比現(xiàn)有方法提高了10倍。這一技術(shù)不僅能夠快速檢測(cè)大腸桿菌O157:H7，還能有效抵抗食品基質(zhì)中的PCR抑制劑，確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
注射器濾膜的創(chuàng)新應(yīng)用
為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度，研究人員引入了注射器濾膜技術(shù)。通過(guò)將樣本溶液通過(guò)注射器濾膜過(guò)濾，能夠快速濃縮目標(biāo)細(xì)菌，顯著提高檢測(cè)效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射器濾膜能夠在短短5分鐘內(nèi)將大腸桿菌O157:H7的濃度提高25倍，極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間。
注射器濾膜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于其便攜性和操作簡(jiǎn)便性。與傳統(tǒng)的真空泵過(guò)濾設(shè)備相比，注射器濾膜無(wú)需復(fù)雜的設(shè)備和電源支持，適合在各種現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境中使用。此外，注射器濾膜的濃縮效果顯著，能夠在短時(shí)間內(nèi)將低濃度的大腸桿菌O157:H7濃縮到可檢測(cè)水平，為快速檢測(cè)提供了有力支持。
圖1基于重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）的CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的序列設(shè)計(jì)。篩選RPA引物（A）：第1行：泳道1 - 4展示了使用引物組1 - 5擴(kuò)增的陽(yáng)性對(duì)照，泳道1N - 4N描繪了使用引物組1 - 5擴(kuò)增的非模板對(duì)照（NTC）。（B）crRNA設(shè)計(jì)，（C）CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的RPA產(chǎn)物順式切割，（C - 1）RPA產(chǎn)物未切割，（C - 2）CRISPR/Cas12a對(duì)來(lái)自線性化靶雙鏈DNA的RPA產(chǎn)物進(jìn)行CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的順式切割。M：50 bp分子量標(biāo)記。
實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與結(jié)果
研究人員通過(guò)在生菜樣本中人工接種大腸桿菌O157:H7，驗(yàn)證了RPA-CRISPR/Cas12a結(jié)合注射器濾膜技術(shù)的檢測(cè)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該技術(shù)能夠在55分鐘內(nèi)完成從樣本處理到檢測(cè)結(jié)果的全過(guò)程，檢測(cè)下限低至101 CFU/g，遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)qPCR方法的102 CFU/g。即使在樣本中含有PCR抑制劑的情況下，RPA-CRISPR/Cas12a技術(shù)依然能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出大腸桿菌O157:H7的存在，而qPCR則因抑制劑的影響而無(wú)法檢測(cè)到高濃度的目標(biāo)細(xì)菌。
圖2. RPA - CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的評(píng)估。(A) RPA - CRISPR/Cas12a的特異性；泳道1 - 4：大腸桿菌O157:H7（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心編號(hào)43895、43889、35150和43890），泳道5 - 12：非大腸桿菌O157:H7（大腸桿菌、糞腸球菌、阪崎克羅諾桿菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和銅綠假單胞菌）。(B) RPA - CRISPR/Cas12a在純培養(yǎng)物中的靈敏度，以及(C) 實(shí)時(shí)PCR的Ct值。NTC，非模板對(duì)照。不同小寫字母表示相對(duì)熒光強(qiáng)度存在顯著差異（P<0.05），不同大寫字母表示Ct值存在顯著差異（P<0.05）。
未來(lái)展望
本研究基于RPA-CRISPR/Cas12a和注射器濾膜的檢測(cè)技術(shù)具有快速、靈敏、便攜的特點(diǎn)使其非常適合用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，能夠有效防止食源性疾病的傳播。未來(lái)，研究人員計(jì)劃將該技術(shù)應(yīng)用于更多種類的食品樣本中，進(jìn)一步驗(yàn)證其在實(shí)際檢測(cè)中的適用性和可靠性。
參考文獻(xiàn)：Lee S Y, Oh S W. Rapid and visual detection of Escherichia coli O157: H7 using an RPA-CRISPR/Cas12a-based syringe filter[J]. Microchemical Journal, 2025, 208: 112624.
來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。
