食品混樣檢測(cè)沙門氏菌，采用不同方法驗(yàn)證其準(zhǔn)確性和一致性
發(fā)布時(shí)間：2024-12-25 瀏覽次數(shù)：164
來(lái)源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“ 六扇門Study”公眾號(hào)，作者~SIXDoors
近期在研究混樣檢測(cè)可行性時(shí)，小六查詢到一篇關(guān)于食品中沙門氏菌混樣檢測(cè)方法的驗(yàn)證的文章《Validation of test portion pooling for Salmonella spp. detection infoods》，摘錄部分重點(diǎn)內(nèi)容跟大家分享。
這個(gè)實(shí)驗(yàn)是為證明不同食品基質(zhì)中沙門氏菌檢測(cè)，混樣（最大375g）增菌檢測(cè)與參考的25 g單獨(dú)增菌檢測(cè)方法是否存在等效性。比較不同食品基質(zhì)，不同檢驗(yàn)方法（培養(yǎng) 、ELISA和RealTime PCR）在檢出概率為50%時(shí)的檢測(cè)限(LOD50)。
驗(yàn)證規(guī)則：
選擇了6大類食品樣本，23種不同的食品基質(zhì)（根據(jù)ISO 16140-2：2016附件A中選擇），基本可涵蓋全球范圍內(nèi)的食品類別。
每種食品基質(zhì)共測(cè)試40個(gè)重復(fù)。制備了20個(gè)單個(gè)測(cè)試部分(25g參考樣本量）和20個(gè)混合試測(cè)試部分(375g替代樣本量），三個(gè)接種水平（低、中、高），每個(gè)接種水平做2個(gè)重復(fù)。
驗(yàn)證方案
菌株添加、操作流程等
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1、菌株添加
不同食品基質(zhì)中添加的沙門氏菌血清型如下表。
不同菌株分別從冷凍培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)移并培養(yǎng)。
用于接種不同基質(zhì)的菌株需要提前模擬亞致死狀態(tài)操作，即：50°C的水浴中孵育10分鐘。通過比較選擇性瓊脂（XLD培養(yǎng)基）上的菌落數(shù)量（CFU）與非選擇性瓊脂（TSA培養(yǎng)基）上的菌落數(shù)量（CFU），估算菌株熱損傷程度。
熱損傷程度在43%~68%之間，與ISO 16140-2：2016要求一致。
2、實(shí)驗(yàn)操作
將375g混合樣本和25個(gè)單獨(dú)樣本，分別加到3375mL和225mLBPW（已經(jīng)提前預(yù)熱到37°C）中，均質(zhì)2min。在37°C±1°C中培養(yǎng)，16h至24h（時(shí)間長(zhǎng)短取決于不同方法）。
注意：對(duì)于含有益生菌的食品，需將10 mg萬(wàn)古霉素溶解于10 ml無(wú)菌水中 使用0.22μm的過濾膜進(jìn)行過濾后，將10ml的萬(wàn)古霉素原液加入到1000 ml的BPW中。
方法1:培養(yǎng)法，參照 ISO 6579:2002，
前增菌培養(yǎng)16 h-20 h后，使用RVS進(jìn)行選擇性增菌，20h-24h后進(jìn)行平板分離，測(cè)定菌落濃度。
整體時(shí)間預(yù)計(jì)：（16 h-20 h）+（20h-24h）+（18 h-24 h）
方法2:GDS法，專有方法
前增菌培養(yǎng)16 h-20 h后，進(jìn)行磁珠富集和熒光PCR檢測(cè)。
整體時(shí)間預(yù)計(jì)：（16 h-20 h）+（2h-2h）+（1.0h-1.5h）
方法3:TPSG法，專有方法
前增菌培養(yǎng)16 h-20 h后，使用RVS進(jìn)行選擇性增菌，之后用ELISA試劑盒檢測(cè)。
整體時(shí)間預(yù)計(jì)：（16 h-20 h）+（18h-24h）+（1.0h-1.5h）
方法4:VIDAS ICS-SLM法，專有方法
前增菌培養(yǎng)18 h-24 h后，使用VIDAS中進(jìn)行自動(dòng)免疫濃縮，在41.5±1.5°C下繼續(xù)培養(yǎng)5-6h后，采用VIDAS進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)。
整體時(shí)間預(yù)計(jì)：（18 h-24 h）+（5h-6h）+（1.0h-1.5h）
方法5:VIDAS Easy SLM法，專有方法
前增菌培養(yǎng)16 h和22 h后，使用專用培養(yǎng)基，在41.5±1.5°C下孵育22 h -26 h，之后采用VIDAS進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)。
整體時(shí)間預(yù)計(jì)：（16 h-22 h）+（22h-26h）+（1.0h-1.5h）
不同檢驗(yàn)方法前增菌培養(yǎng)時(shí)間要求如下表：
專有檢驗(yàn)方法，已被驗(yàn)證過的檢出限如下表：
結(jié)果分析
檢出限、檢出率
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1、不同方法檢出限測(cè)試結(jié)果
采用最長(zhǎng)增菌時(shí)間培養(yǎng)方案進(jìn)行測(cè)試，23種食品基質(zhì)種有21種測(cè)下下來(lái)，RLOD50 < 2.5，是可以接受的。
在所有測(cè)試方法和條件下，只有一種食品（N° 19巧克力醬）結(jié)果不佳，可能與含有抑菌成分有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。
2、最長(zhǎng)和最短前增菌時(shí)間的研究
為了研究最短和最長(zhǎng)前增菌時(shí)間對(duì)混樣及單個(gè)測(cè)試結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)對(duì)每種方法和食品基質(zhì)都進(jìn)行了LOD50測(cè)試。對(duì)25 g樣品進(jìn)行的460個(gè)計(jì)算，有15個(gè)在最短和最長(zhǎng)前增菌時(shí)間后的LOD50值均為>1 MPN。然而在最短前增菌時(shí)間時(shí)，混樣增菌的LOD50>1 MPN的兩倍（如下圖），顯然，當(dāng)使用最短的前增菌時(shí)間時(shí)，混合樣本的LOD50更高。
與 25 g單一測(cè)試相比，375 g混樣測(cè)試的最短和最長(zhǎng)預(yù)增菌培養(yǎng)時(shí)間的 LOD50 值不同，這可能是因?yàn)槟承┦称肺⑸锷L(zhǎng)受阻有關(guān)。
事實(shí)上，假設(shè)微生物在前增菌的培養(yǎng)液中隨機(jī)分布，“為了確保在1ml預(yù)增菌培養(yǎng)物中至少可被轉(zhuǎn)移1個(gè)目標(biāo)菌，要求每ml培養(yǎng)物中至少平均存在7個(gè)活菌。” (Jarvis, 2007)。
考慮到沙門氏菌在37°C下的最大指數(shù)生長(zhǎng)期μ = 0.8-0.9 log cfu/ml/h（Juneja和Marks，2006，Zheng等人，2013），混合樣品（375 g在3.750 L）將比（25 g在225mL）至少需要多培養(yǎng)1.3h-1.5h，才能達(dá)到大致相同的濃度。
這種差異可能會(huì)對(duì)亞致死熱處理?yè)p傷的沙門氏菌的假陽(yáng)性率產(chǎn)生很大影響，其中滯后期可能大于4h (Juneja and Marks, 2006)，并且對(duì)于存在背景菌群或抑制劑的樣品也是如此。
3、不同方法陽(yáng)性檢出率結(jié)果
前增菌24h后（最長(zhǎng)時(shí)間），測(cè)定了沙門氏菌的檢出水平（log10cfu/ml）。結(jié)果表明，在5 log10 cfu/ml的水平下，測(cè)試方法均可檢出（95%為陽(yáng)性） ，在濃度為3 log10 cfu/ml的情況下，無(wú)論方法如何，82%的樣品檢測(cè)出沙門氏菌陽(yáng)性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
??對(duì)于多種食品基質(zhì)，375g混樣增菌后，無(wú)論采用何種檢測(cè)技術(shù)，LOD50結(jié)果是可接受的，并且與25g單檢和375 g混樣，經(jīng)過驗(yàn)證具有很好的一致性。
??在所有測(cè)試的方法和條件下，只有一種食品（N° 19巧克力醬）結(jié)果不佳，可能與含有抑制成分有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。
??前增菌培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)出更好（具有高LOD50的基質(zhì)數(shù)量較少）。
??前增菌后沙門氏菌的最終濃度對(duì)不同方法的陽(yáng)性檢出率沒有較大影響。
