一、菌種傳代次數(shù)：經(jīng)驗(yàn)值還是理論值？

將菌種的傳代次數(shù)控制在5代以內(nèi)是一項(xiàng)經(jīng)過長期實(shí)踐驗(yàn)證的經(jīng)驗(yàn)結(jié)論。這一指導(dǎo)原則的確立，旨在避免多次傳代可能導(dǎo)致菌種遺傳特性喪失或者發(fā)生變異。這一變異可能影響其在研究和生產(chǎn)中的穩(wěn)定性和生物活性。

通過限制傳代次數(shù)至5代以內(nèi)，可以有效減少遺傳變異的風(fēng)險(xiǎn)，從而確保菌種在實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)中保持穩(wěn)定的遺傳特性及生物活性。這不僅提升了實(shí)驗(yàn)的可靠性，也保障了生產(chǎn)環(huán)節(jié)的產(chǎn)品質(zhì)量。嚴(yán)格遵循傳代控制要求，不僅是對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種保障，也是對菌種長久穩(wěn)定利用的責(zé)任。因此，這一經(jīng)驗(yàn)值在許多專業(yè)領(lǐng)域被廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。

“5代”這一限制既是基于長期微生物學(xué)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，也具有一定的理論依據(jù)。這一傳代次數(shù)限制的設(shè)立旨在避免由于過多傳代導(dǎo)致的菌種退化或遺傳變異，從而確保在研究和生產(chǎn)中所使用的菌種保持其穩(wěn)定的遺傳特性和生物活性。

這一數(shù)字并非隨意制定，而是依托大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為5代是一個(gè)合理的上限，能夠有效維持菌種的穩(wěn)定性和可靠性。在許多生物技術(shù)應(yīng)用中，遵循這項(xiàng)傳代限制已經(jīng)成為確保實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)一致性的重要保障。通過嚴(yán)控傳代次數(shù)，科學(xué)家可以更大程度地確保結(jié)果的可重復(fù)性和產(chǎn)品的高質(zhì)量。

二、菌種傳代次數(shù)必須在5代以內(nèi)？超過5代是否可行？

根據(jù)微生物學(xué)常識，菌種的傳代次數(shù)與其遺傳變異率之間存在正相關(guān)關(guān)系：傳代次數(shù)越多，變異的風(fēng)險(xiǎn)也就越高。雖然技術(shù)上并非完全禁止使用超過5代的菌種，但在超過5代后，菌種的穩(wěn)定性和可靠性可能會(huì)受到挑戰(zhàn)，增加意外問題出現(xiàn)的可能性。

只有在經(jīng)過5代傳代后，經(jīng)過細(xì)致檢查確認(rèn)菌種的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性等依然保持不變的情況下，才可考慮繼續(xù)使用。但即便如此，多個(gè)傳代在實(shí)驗(yàn)過程中仍然被不建議，因?yàn)檫@會(huì)顯著增加變異和風(fēng)險(xiǎn)的可能性，這在實(shí)驗(yàn)及生產(chǎn)中被視為一種風(fēng)險(xiǎn)行為。因此，嚴(yán)格控制菌種傳代在5代以內(nèi)是基于豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來的最佳實(shí)踐方法，以確保實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)流程在準(zhǔn)確性和可靠性上保持不變。堅(jiān)持這一經(jīng)驗(yàn)法則不僅是在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，更是在規(guī)避不必要的研究風(fēng)險(xiǎn)。

三、限制傳代次數(shù)依據(jù)是什么？

根據(jù)《中國藥典：2020年版·四部-9203藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則》，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制在不超過5代以內(nèi)。起始代數(shù)為從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株，計(jì)為第0代。這一規(guī)定的設(shè)置旨在防范多次傳代所可能導(dǎo)致的菌種遺傳變異風(fēng)險(xiǎn)。

在具體操作中，一次傳代被定義為將活的培養(yǎng)物接種到新的微生物生長培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。無論形式如何，任何轉(zhuǎn)種操作均被視為一次傳代。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，實(shí)驗(yàn)室在有必要時(shí)需對工作菌株的特性和純度加以確認(rèn)。

在實(shí)踐中，標(biāo)準(zhǔn)菌株被視為第0代，而其衍生的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株為第1代，隨后的儲(chǔ)備菌株為第2代（儲(chǔ)備菌株亦可作為工作菌株使用）。這意味著，工作菌株的第1代W1實(shí)際上相當(dāng)于第2代菌株。根據(jù)“不超過5代”的規(guī)定，工作菌株可用的傳代代數(shù)實(shí)際為W1、W2、W3和W4。在此之后，繼續(xù)傳代將會(huì)大大增加菌種發(fā)生變異的幾率，因此不建議進(jìn)行超限傳代。

四、如何妥善保藏菌種？

根據(jù)《中國藥典：2020年版·四部-9203藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則》，建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍（低于-30°C）等方法來保存菌種。這些方法能夠有效延長菌種的保存時(shí)間，尤其是低于-70°C的冷凍方式或冷凍干燥技術(shù)。此外，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株可以用于每月或每周一次的轉(zhuǎn)種，以制備工作菌株。

需要特別注意的是，一旦冷凍菌種被解凍并用于制備工作菌株后，不得再重新冷凍或再次使用原凍存管。這是為了確保菌種的穩(wěn)定性和純度不會(huì)受到不必要的影響。因此，除了嚴(yán)格控制傳代次數(shù)在5代以內(nèi)以減少變異風(fēng)險(xiǎn)之外，還必須遵循適當(dāng)?shù)木N保存方法，以確保菌種的質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

五、實(shí)際操作中，如何確認(rèn)是那一代菌種？

①. 在實(shí)際實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，有些實(shí)驗(yàn)室對菌種管理極為嚴(yán)格，而另一些實(shí)驗(yàn)室可能顯得較為混亂。由于實(shí)驗(yàn)的人員頻繁更替和菌種的頻繁使用，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)難以追蹤菌種代數(shù)的問題。面對這種普遍現(xiàn)象，我們只能以收到的菌種作為基礎(chǔ)，將其視為第0代。

②. 當(dāng)接收到新的菌種時(shí)，我們首先需要進(jìn)行簡單的形態(tài)學(xué)鑒定以及生理生化特性檢測，以評估菌株的活力。如果這些指標(biāo)沒有問題，那么該菌種可以被視為F0，即母代菌種。但需要明確的是，這樣的做法并不符合《中國藥典》中規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)第0代菌種。

③. 這種方法僅作為臨時(shí)參考，并不適用于嚴(yán)格要求的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。為了確保實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可靠性，還是應(yīng)盡力遵循規(guī)定的實(shí)驗(yàn)菌種管理流程，標(biāo)準(zhǔn)化菌種的保存和使用，以避免在傳代過程中出現(xiàn)更多不確定性。

六、菌種復(fù)蘇與傳代

1. 復(fù)蘇：在無菌環(huán)境中打開冷凍干燥菌種管，加入適量的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液的選擇應(yīng)根據(jù)菌種的特性進(jìn)行，如細(xì)菌使用營養(yǎng)肉湯，白色念珠菌使用沙堡液體培養(yǎng)基，分枝桿菌使用蘇通綜合液體培養(yǎng)基，而黑曲霉菌則使用麥芽浸膏營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。通過幾次上下吸吹的方式，使菌種充分融化并分散。之后，將菌種懸液適量滴入含有5.0 mL～10.0 mL相應(yīng)培養(yǎng)液的試管中，并在適宜溫度下培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間。通常條件為36℃±1℃培養(yǎng)18 h～24 h，而黑曲霉菌則需要在30℃±1℃培養(yǎng)42 h～48 h，此過程產(chǎn)出的是第1代培養(yǎng)物。

2. 傳代至第2代：利用接種環(huán)從第1代培養(yǎng)物中取樣，或直接從冷凍保存的菌種管中取出適量菌液或瓷珠，將其劃線接種于適合的培養(yǎng)基平板。根據(jù)不同的菌種，選擇適宜的培養(yǎng)基。例如，細(xì)菌使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌使用沙堡瓊脂培養(yǎng)基，分枝桿菌使用改良羅氏培養(yǎng)基或其他專用復(fù)合瓊脂培養(yǎng)基，黑曲霉菌使用麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基。在適宜溫度下培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間，即為第2代培養(yǎng)物。

3. 傳代至第3代：選取第2代培養(yǎng)物中的典型菌落，接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面或平板。培育條件同樣依據(jù)菌種進(jìn)行選擇。如需可用：細(xì)菌使用營養(yǎng)瓊脂斜面，白色念珠菌用沙堡瓊脂斜面，分枝桿菌則用改良羅氏菌培養(yǎng)基或?qū)Ｓ脧?fù)合瓊脂斜面，黑曲霉使用麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基平板。這一過程得到第3代培養(yǎng)物。

4. 傳代至第4代：從第3代培養(yǎng)物取樣，接種在合適的培養(yǎng)基斜面，在適宜溫度下培養(yǎng)，直至達(dá)到期望的時(shí)間并形成第4代培養(yǎng)物。

5. 傳代記錄：繼續(xù)傳至所需代數(shù)時(shí)，需在傳代試管上明確標(biāo)記菌種名稱、菌種編號、代數(shù)及傳代日期等基本信息，以便追蹤和管理菌種傳代過程的準(zhǔn)確性。

文章來源：環(huán)凱（官網(wǎng)：huankai.com）轉(zhuǎn)載于“  Dr實(shí)驗(yàn)助手 ”公眾號；原作者~ 實(shí)驗(yàn)軼。
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